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比较基因组杂交

Wikipedia · 2025-12-07 维基百科 👁 1 阅读

比较基因组杂交（，CGH）是一种分子细胞遗传学方法，在不培养细胞的情况下，分析相对于参照样品，测试样品的DNA中拷贝数变异（CNV）的多倍性程度。其目的是快速有效地比较两个来源的两组DNA样本，这两组DNA通常是密切相关的，因为两者在整个染色体或亚染色体区域（整个染色体的一部分）上都可能有获得或丢失。该技术最初是为了评估实体瘤和正常组织的染色体互补差异而开发的，相比更传统的Giemsa显带技术和荧光原位杂交技术（FISH）（受限于所使用的显微镜分辨率），它的分辨率提高到了5-10Mb。

这项技术是通过竞争性荧光原位杂交实现的。简言之，从待比较的两个样品（通常是测试和参照样品）中分离DNA，用不同颜色（通常是红色和绿色）的荧光团（荧光分子）分别标记两组DNA样品， 变性DNA使其成为单链，再将两组的1：1混合物与正常中期染色体进行杂交，并且结合在原位。然后使用荧光显微镜和计算机软件，纵向比较杂交染色体荧光信号的着色差异，以鉴别两组的染色体差异。杂交染色体特定区域中的测试样品颜色较强，表示测试样品中该区域有获得，而参照样品颜色较强表示测试样品中有丢失。中性色（黄色，当同时标记红色和绿色）则表示两个样品在该区域没有差异。这种改进的技术可以发现已知和未知的致病位点。

历史
发展CGH的动机：显微镜限制了当时可用的细胞遗传学分析技术（G显带和FISH）的分辨率。此外G显带解释模糊，准确性偏低，而且这两种技术都需要投入大量人力，这就对可检查位点造成了限制。

最初难以推广CGH技术，因为实验设计不统一而彼此不一致，特别是数据的解释不确定，并且图像分析软件可以商业化，这使得CGH在世界各地得到应用。1998年，Pinkel等人则用其来分析乳腺癌细胞。以上都是借助人类基因组计划实现的，该计划创造了一个DNA克隆片段文库，包括整个人类基因组的已知位点，而这些片段被用作DNA微阵列上的探针。现在各种来源的探针，如cDNA、基因组PCR产物和细菌人工染色体（BACs）可用于DNA微阵列，总计可达200万个探针。

基本方法
中期载玻片制备
从核型正常的男性或女性获得参照样品DNA，置于载玻片上，优先使用女性DNA，因为它们具有两条X染色體，其含有比男性Y染色体更多的遗传信息。使用植物血凝素刺激外周血中的淋巴细胞。将1ml肝素化血液加入10ml培养基中，并在37℃、5%CO2环境下培养72小时。加入秋水仙碱中止细胞的有丝分裂，然后分离出细胞并用低渗氯化钾处理，固定在3：1的甲醇/乙酸中。

阵列比较基因组杂交
阵列比较基因组杂交（基于微阵列的比较基因组杂交，矩阵CGH，阵列CGH，aCGH）是一种分子细胞遗传学技术，能在基因组范围内高分辨率地检测染色体的拷贝数变化。阵列CGH将患者的基因组与参照基因组进行比较，鉴定两个基因组之间的差异，并利用与传统CGH相同的竞争性荧光原位杂交原理来定位患者基因组失衡的区域。

阵列CGH克服了传统CGH的主要缺点—低分辨率。在阵列CGH中，中期染色体被DNA克隆片段（+100-200kb）取代，其中确切的染色体位点是已知的。这样可以更详细地检测畸变，而且可以将变化直接映射到基因组序列上。

阵列CGH已被证明是一种特异、灵敏、快速和高通量的技术，与其他分析DNA拷贝数变化的方法相比具有相当大的优势，更适合应用于诊断。使用这种方法，可以检测到5-10kb水平的拷贝数变化。截至2006年，高分辨率CGH（HR-CGH）阵列能以200 bp的分辨率准确检测结构变异（SV）。该方法能够识别新的复发性染色体变化，例如由于染色体畸变导致的癌症和先天性缺陷的微缺失和重复。

方法
阵列CGH基于与传统CGH相同的原理。在这两种技术中，用两种不同的荧光团对来自参照（或对照）样品的DNA和来自测试（或患者）样品的DNA进行差异标记，并用作与靶标核酸竞争性共杂交的探针。在传统CGH中，靶标是参照的中期染色体。在阵列CGH中，这些靶标可以是克隆在多种载体（如BACs或质粒）、cDNA或寡核苷酸中的基因组片段。

图1。

阵列CGH的技术方法
阵列CGH是通过各种技术实现的，因此它的优缺点取决于所选择的技术。最初的方法是插入大片段的克隆DNA（例如BACs）产生阵列。BACs的使用提供了足够强烈的信号来检测单拷贝变化并准确定位畸变边界。然而分离的BACs克隆的初期DNA产量低，必需DNA扩增技术。这些技术包括连接介导的聚合酶链反应（PCR），使用一组或几组引物的简并引物PCR，以及滚环扩增。也可以使用cDNA构建阵列，这些阵列具有高空间分辨率，但cDNA的数量受到染色体上编码基因的限制，并且由于交叉杂交它们的灵敏度很低。最新的方法是用短寡核苷酸点样阵列。寡核苷酸的数量几乎是无限的，并且处理快速、经济有效和简单。尽管寡核苷酸不具有检测单拷贝变化的灵敏度，但是在染色体上彼此相邻的寡核苷酸的比率的平均值可以补偿降低的灵敏度。也可以使用具有重叠探针的阵列，以便揭示特定的断点。

设计方法
CGH应用的微阵列设计有两种：全基因组和靶向。

全基因组阵列设计覆盖整个人类基因组，通常包括在整个基因组中广泛覆盖的克隆，以及在基因组范围内具有连续覆盖的阵列。全基因组阵列主要用于研究，在发现基因方面有突出价值。它们以空前的分辨率筛选基因组的DNA获得和丢失，这也非常有价值。该方法还可用于研究胎儿和新生儿基因组中的染色体畸变。此外，传统CGH可用于检测染色体异常，并已被证明可有效诊断与人类遗传疾病相关的复杂异常。这些变化中的一些似乎对于各种恶性肿瘤是常见的，而其他变化则更具肿瘤特异性。例如，染色体区域lq、3q和8q的获得，以及8p、13q、16q和17p的丢失，对于许多类型的肿瘤是常见的，比如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌和膀胱癌（图2）；其他改变，如睾丸癌的12p和Xp获得，膀胱癌的13q获得和9q丢失，肾癌的14q丢失以及卵巢癌的Xp丢失，它们更具特异性，这可能反映了不同器官癌症发展过程中独特的选择。

染色体畸变
猫叫综合征（CdC）是由5号染色体短臂的部分缺失引起的综合征。一些研究表明，传统CGH适用于检测缺失以及更复杂的染色体改变。例如，Levy等人在2002年报道了一个像猫一样哭泣（这是CdC的特点）的婴儿，但其核型模糊。CGH分析揭示染色体的5p15.3区段丢失，证实了临床诊断。这些结果表明，传统CGH是检测结构畸变的可靠技术，在特定情况下可以更有效地诊断复杂的异常。在最近的一项研究中，使用阵列CGH识别数个乳腺癌小鼠模型中的染色体畸变（拷贝数变异）区域，从而在myc诱导的肿瘤发生过程中鉴定出合作基因。

阵列CGH不仅可以发现癌症的染色体异常，还可以监测肿瘤的发展。一旦通过阵列CGH识别出异常，可以采用FISH区分转移性和轻度病变。细胞遗传学或传统CGH无法检测到这些小的畸变，但阵列CGH可以轻松检测到。为了证明其原理，Vissers等人在2003年制造了具有1Mb分辨率的全基因组范围阵列，以筛查三名具有已知微缺失综合征（经FISH验证）的患者，其中一名患有PWS。在三名患者中容易发现1.5-2.9Mb的异常。由此证明阵列CGH是检测亚微观畸变的特效且敏感的方法。

当使用重叠微阵列时，还可以揭示染色体畸变中的断点。

产前基因诊断
虽然阵列CGH尚未被广泛用作胚胎植入前的遗传筛查，但是它的概念正越来越普及。它可以检测卵子、精子或胚胎中的CNV和非整倍性，这些可能导致胚胎植入失败、流产或唐氏综合症（21三体综合征）等疾病。这使得阵列CGH成为一种有前途的工具，可以降低终身恶性疾病的发病率和提高体外受精的成功率。该技术涉及单细胞的全基因组扩增（用于阵列CGH）。它也可以用于携带染色体易位的夫妇，例如平衡的互易易位或罗伯逊易位，它们有可能在其后代中引起染色体失衡。

CGH和阵列CGH的局限性
传统CGH的主要缺点是不能检测没有拷贝数变化的结构染色体畸变，例如镶嵌体、平衡染色体易位和倒位。CGH也只能检测倍性水平的获得和丢失。另外，具有短重复序列的染色体区域在个体之间变化很大，并且可能干扰CGH分析。此外，传统CGH的分辨率是限制其临床应用的主要问题。尽管CGH已被证明是癌症和人类遗传疾病研究和诊断中有用且可靠的技术，但这些应用仅涉及严重异常。由于中期染色体的分辨率有限，使用传统CGH无法检测到小于5-10 Mb的畸变。

参见
*细胞遗传学 虚拟核型

参考文献
外部链接

#分子遺傳學 #细胞遗传学 #基因检测 #比較學

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