空间转录组学

的共聚焦显微镜图像数据与空间转录组学数据。]]
空间转录组学（Spatial Transcriptomics）或称空间分辨转录组学（Spatially Resolved Transcriptomics），是一种在完整组织内捕获转录活性位置背景的方法。 空间转录组学的历史前身是原位杂交（in situ hybridization）， 而现代的组学术语指的是测量细胞中所有的mRNA，而非选择特定的RNA靶标。它是空间生物学的重要组成部分。

空间转录组学包含的方法可分为两种模式：基于下一代测序的基因检测方法，以及基于成像的方法。 解析转录本空间分布的一些常见方法包括显微切割技术、荧光原位杂交方法、原位测序、原位捕获方案和计算机模拟（in silico）方法。

历史
原位杂交技术在20世纪60年代末由约瑟夫·G·加尔和Mary-Lou Pardue开发，并在20世纪80年代随着单分子FISH（smFISH）的出现，以及2010年代随着RNAscope、seqFISH、MERFISH和osmFISH、seqFISH+以及DNA显微镜的出现取得了重大发展。

空间基因组学作为一项技术（现在被称为空间转录组学），是由Michael Doyle（Eolas公司）、Maurice Pescitelli（伊利诺伊大学芝加哥分校）、Betsey Williams（哈佛大学）和George Michaels（乔治·梅森大学）在20世纪90年代发起的，作为可视胚胎项目（Visible Embryo Project）的一部分。Doyle及其共同研究人员描述了一种称为基因组活性空间分析（Spatial Analysis of Genomic Activity, SAGA）的方法。

这一空间索引概念在2016年被瑞典斯德哥尔摩的Jonas Frisén、Joakim Lundeberg、Patrik Ståhl及其同事进一步扩展。2019年，首批空间转录组学商业平台问世，包括NanoString Technologies推出的GeoMx数字空间轮廓分析仪（DSP）以及10x Genomics推出的Visium。同年，在博德研究所，Fei Chen和Evan Macosko的实验室开发了Slide-seq，该技术使用了附着在微珠上的条形码寡核苷酸。

应用
明确mRNA分子的空间分布有助于检测组织、肿瘤和免疫细胞中的细胞异质性，以及确定转录本在各种条件下的亚细胞分布]]

显微切割
激光捕获显微切割
激光捕获显微切割（Laser capture microdissection，LCM）能够在不引起形态改变的情况下捕获单细胞。它利用与组织切片贴合的透明乙烯-乙酸乙烯酯薄膜和低功率红外激光束。该方法在不使用激光捕获显微切割的情况下进行。它首次被用于确定冷冻切片果蝇胚胎中基因表达的全基因组空间模式。由于能够长期保存组织结构，FFPE是病理学和组织学领域的常见样本类型。GeoMx DSP技术的核心在于用户能够基于组织学结构、功能区室和细胞类型进行“显微切割”。然而，与LCM不同，基因表达分析是通过光以非破坏性方式进行的，这得益于工程化到原位杂交探针中的紫外光可切割条形码。为此，显微镜载玻片上的组织切片用荧光抗体和核染料进行染色，以便在DSP仪器上以单细胞分辨率可视化整个组织切片。定义的感兴趣区域大小可以在十到六百微米之间变化，允许包含组织学样本中的多种结构和细胞。GeoMx DSP可以在空间上解析和测量人类或小鼠的整个转录组，超过1200种蛋白质，或在同一载玻片协议中进行RNA和蛋白质的多组学分析。

TIVA
TIVA（Transcriptome in vivo analysis）是一种在完整活体组织切片中捕获活体单细胞内mRNA的技术。它使用光激活标签。它也基于组织冷冻切片以及随后的单个切片RNA测序，产生全基因组表达数据并保留空间信息。由于在LCM过程中记录了每个细胞的位置身份，在对相应的cDNA文库进行RNA测序后，可以推断出每个细胞的转录组到其分离的位置、中间神经元、多巴胺神经元和软骨细胞。

Geo-seq
Geo-seq是一种同时利用激光捕获显微切割和单细胞RNA测序程序来确定约十个细胞大小的组织区域中转录组空间分布的方法。其工作流程涉及去除和冷冻切片组织，然后进行激光捕获显微切割。然后裂解提取的组织，纯化RNA并反转录成cDNA文库。被荧光标记物结合的细胞被光激活、解离，并通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分选。初始的温和消化步骤保留了微小的相互作用结构，这些结构在继续消化之前被记录下来。基于微消化前的相互作用结构，可将聚集的细胞映射到物理相互作用上 以及64种经验证的蛋白质分析物，并且是一个灵活的、具有空间解析度的[https://nanostring.com/products/cosmx-spatial-molecular-imager/single-cell-imaging-overview/ 单细胞成像] 平台，可用于细胞图谱绘制、组织表型分析、细胞-细胞相互作用、细胞过程和生物标志物发现。

smFISH
单分子荧光原位杂交（single-molecule fluorescent in situ hybridization，smFISH）是首批能够实现单细胞空间分辨RNA分析的技术之一。它采用了结合有5个荧光基团的短序列（50碱基对）寡核苷酸探针，这些探针可以结合特定的转录本，在样本中产生亮点，将上述探针替换为20 bp长的探针，仅连接一个荧光基团，并串联地与感兴趣的mRNA序列互补，这意味着它们将集体结合到目标mRNA上。单个此类探针本身不会产生强信号，但聚集探针的累积荧光将显示出一个亮点。由于错误结合的单个探针不太可能共定位，因此该方法中的假阳性信号受到限制。。它允许在各种细胞类型中可视化单个RNA。RNAscope的大多数步骤与经典的ISH协议相似。该方法通过多轮进行；每一轮都包括荧光探针杂交、成像和随后的探针剥离。多重防错FISH（Multiplexed Error-Robust FISH，MERFISH）通过在多轮杂交中采用二进制代码基因标记，大大增加了单细胞中可同时成像的RNA种类数量。这种方法使用能够检测并纠正错误的编码方案，可以一次测量140种RNA。在该方法中，多个读出探针与mRNA的目标区域结合 在osmFISH中，首先可视化转录本，获取图像后剥离探针，并用不同的荧光探针可视化新的转录本。 它支持单分子和多重读出。 它还包含一条易用型计算分析流水线。

seqFISH+
SeqFISH+通过后续几轮的荧光解决了与空间拥挤相关的光学问题。 首先，初始探针退火结合到目标mRNA上，随后的探针再结合到初始探针的侧翼区域，从而产生独特的条形码。 首先，固定细胞并合成cDNA。基于锁式探针/挂锁探针（padlock probing）、 滚环扩增（RCA） 以及连接测序（sequencing by ligation chemistry）。 在完整的组织切片内，mRNA被逆转录为cDNA，随后由RNase H进行mRNA降解。与ISS padlock类似，是一种使用逆转录、滚环扩增和连接测序技术的方法。 与其他基于挂锁探针的方法类似，通过滚环扩增进行放大。
它结合了原位捕获和DNB-seq。DNB测序基于用于原位测序的平版刻蚀芯片（图形化阵列）。与其他微米级别的原位捕获技术不同，标准DNB芯片具有直径约220 nm的斑点，中心距为500 nm，每10毫米线性距离可为组织RNA捕获提供多达20000个斑点，即每1平方厘米有4 × 108个斑点。因此，STOmics可以表现出比其他原位捕获技术更高的分辨率和更宽的视野。

空间转录组学（技术）
第一个被广泛采用的方法由Ståhl等人在2016年发表于Science杂志的一篇里程碑论文中描述，，作为10X Visium平台的基础。

Slide-seq
Slide-seq依赖于将结合RNA、带有DNA条形码的微珠附着在涂有橡胶的玻璃盖玻片上。 该方法利用在活细胞中表达的APEX2基因，这些活细胞与生物素-酚和过氧化氢一起孵育。 这是通过顺序杂交到每个微珠的条形码寡核苷酸序列来完成的。

Takara Bio SEEKER
该[https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/spatial-omics/seeker-spatial-transcriptomics-kit] 测定法在概念上类似于10X Genomics Visium，但具有更高的斑点密度。与10X Genomics Visium HD（该方法使用的是针对人或小鼠等物种预定义的RNA探针）相反，SEEKER具有类似的密度和分辨率，但能够对任何新鲜冷冻组织样本进行测定，它利用了样本中所有mRNA的poly-A接头进行测序。

计算机模拟构建
使用ISH进行重建
计算机模拟ISH空间重建（in silico Spatial Reconstruction with ISH）是指根据细胞的表达谱对其位置进行计算式空间重建。 它们共同分析相同细胞类型的单细胞转录组学以及可用的基于ISH的基因表达图谱。 Distmap算法利用测序细胞的转录组和上述参考图谱生成目标组织的虚拟3D模型。 基本上，该算法获取解离组织中产生的单细胞数据，并能够使用虚拟原位杂交将单个转录本映射到该细胞类型在组织中的位置。

参见

• 荧光原位杂交
• RNA-Seq
• 单细胞测序
• 空间生物学

参考文献