荧光光谱

荧光光谱是指某些物质经某波长入射光照射后，分子从能级Sa被激发至能级Sb，并在很短时间内去激发从Sb返回Sa，发出波长长于入射光的荧光。

荧光光谱原理
设分子能级为基态Sa，激发态Sb。

分子在能级Sa和Sb上的分布按照波尔兹曼分布规律：
:n_b/n_a=e^{-(E_b-E_a)}=e^{-h\nu/kT}

基态上分子数目变化速率为
: -\frac{dn_a}{dt}=I(\nu)n_aB_{ab}-I(\nu)n_bB_{ba}-n_bA_{ba}
平衡时（稳定态），上式为0：
又有：

迁移几率（爱因斯坦系数）
:B_{ab}=B_{ba}=\frac{2\pi}{3\hbar^2}D_{ab}
偶极强度
:D_{ab}=\mid\mid
频率ν处的入射光强
:I(\nu)=\frac{8{\pi}h{\nu^3}}{c^3(e^{h{\nu}/kT}-1)}
推导出：
Sb通过发射光子从回到Sa的几率，即衰减常数λ
:A_{ba}=(\frac{32{\pi^3}{\nu^3}}{3c^3\hbar})\mid\mid

Sb上的分子去激发速率
:\frac{dn_b}{dt}=-A_{ba}n_b
上式的一个解为
:n_b(t)=n_b(0)e^{-A_{ba}t}

可见激发态上的分子数目以指数形式衰减，衰减常数为Aba
Sb的辐射寿命为（此处参考指数衰减）
:\tau_R=\frac{1}{A_{ba}}
此仅当吸收的光子和随后发射的光子相同时候有效，即全部吸收的光能量通过辐射过程全部发出光子消耗掉。
而实测时激发态寿命很少和上述寿命一致，因为激发态除了直接发射光子外有很多其他途径失去能量。

Sb通过发出荧光回到Sa的过程的反应速率，即固有荧光速率常数 kF
:k_F=A_{ba}=\frac{1}{\tau_R}
Sb回到Sa的其他非辐射途径包括内转变，系统间转变，猝熄作用，其速率常数分别为kIC,kIS,kQ[Q]
则Sb总的去激化（熄灭）常数为kF+kIC+kIS+kQ[Q]

荧光量子产率
:\phi_F=\frac{k_F}{k_F+k_IC+k_IS+k_Q[Q]}
也可以写作发射光子数/吸收光子数，即发射的荧光光子数/入射光照射时的吸收量

因为大量的非辐射过程的存在，所以激发态实际衰减时间远小于理想的辐射寿命τR
描述此动力学过程
:-\frac{d[S_b]}{dt}=(k_F+k_IC+k_IS+k_Q[Q])[S_b]
此方程的一个解为
:S_b(t)=S_b(0)e^{-t/\tau_F}
Sb是激发态上的分子数

斯托克斯位移
吸收曲线的0,0跃迁与发射曲线的0,0跃迁不重合，之间有一位移，荧光光谱较相应的吸收光谱红移。
原因是分子在处于激发态期间进行了重定向/重排布，消耗了能量，故荧光光谱的0,0峰向低能量（高波长）方向平移。

荧光强度
:A=\epsilon cl=lg\frac{I_0}{I}

得到

:I=I_0 e^{-2.303\epsilon cl}

观测发射强度为

:F(\lambda) = 2.303\epsilon clI_0\phi_Ff(\lambda)d=\epsilon\phi_Ff(\lambda)cI_0k
k=2.303ld

给一束脉冲入射光后，发射光在脉冲后的时间t时的强度I(t)，与激发态的衰减率dSb/dt及激发态通过荧光衰减的比率φF（量子产率）成比例：

:I(t)=\frac{dS_b}{dt}\phi_F=S_b(0)(\frac{\phi_F}{\tau_F}e^{-t/\tau_F}=k_FS_b(0)e^{-t/\tau_F}

随时间表现为指数衰减

系统内有一种荧光物质时：

:E_m(t)=Ae^{-t/\tau_F}

系统中有两种荧光物质时：
:E_m(t)=A_1e^{-t/\tau_{1F}}+A_2e^{-t/\tau_{2F}}

Em是荧光强度，上述公式为荧光衰减（decay）公式

内部滤光效应
对高浓度溶液而言，荧光的再吸收不能忽略。大部分入射光在系统前半部分被吸收，发射的荧光被再吸收，只有少量的荧光通过狭缝入射到荧光探测器上，使得探测到的荧光强度减少。

外环境影响
去激发同样可能由于碰撞或和溶剂分子的混合导致，以速率kQ[Q]发生。和其他过程不同，考虑碰撞时此猝熄是一个双分子过程。
Sb + Q → Sa + Q (kQ[Q])

因为Q通常浓度远大于Sb ，此过程被视为一个伪一级反应，kQ[Q]的值可通过变化猝熄剂Q的浓度，观察对φF的影响测得。芳香类发色基的辐射寿命通常为110-9到10010-9秒。因此，相比较而言，猝熄过程是相当有效率的。普遍的猝熄剂如O2和I-离子，每和激发态分子碰撞一次就会使其去激发一次。此反应速率仅被扩散限制。在微摩尔浓度猝熄剂下，碰撞发生速率为108每秒，因此可以观察到明显的猝熄。

:\frac{F_0}{F}=\frac{\phi_0}{\phi}=\frac{k_F+k_IC+k_IS+k_Q[Q]}{k_F+k_IC+k_IS}=1+k_Q[Q]

τ0可测，以F0/F对[Q]作图求得kQ

荧光共振能量迁移
简称FRET，此过程适用与计算两端带发色基的高分子长度。

存在供体D和受体A，当光入射时，激发基态供体Da→Db，Db又去激发，通过共振将能量传递给Aa，使得Aa→Ab。

定义迁移效率（E）是Db去激发传递能量到Aa占总Db去激发的比例

:E=\frac{k_T}{k_T+k_F^D

通过一系列复杂的计算和变化，此处省略，得：

:k_T=\frac{1}{\tau_0}\frac{R_0}{R}
:R_0=9.7*10^3(J\kappa^2n^{-4}\phi_D)^{\frac{1}{6}} cm
: J=\int \epsilon(\nu)f_D(\nu)\nu^{-4}\, d\nu

推导出：
:E=\frac{R_0^6}{R_0^6+R^6}

这里R0对一个固定的化学系统而言是常数，R是供体和受体之间的距离，R越接近R0，测计算越精确。

此外计算E的方法有：
:\frac{\phi_{D+A}}{\phi_D}=1-E
:\frac{F_{D+A}}{F_A}=1+\frac{\epsilon_Dc_D}{\epsilon_Ac_A}E
:\frac{\tau_{D,A}}{\tau_D}=1-E

参考文献
*C.P Cantor & P.R. Schimmel, BIOPHYSICAL CHEMISTRY, Part II. Techniques for the study of biological structure and function. Page 433-465.